Mẫu thực phẩm được thuỷ phân trong môi trường acid đem ủ ở 37⁰C qua đêm với sự có mặt của men Amilase. Dịch thuỷ phân được lọc và bơm vào hệ thống HPLC với detector huỳnh quang ở bước sóng kích thích Ex= 422 nm và bước song phát xạ Em = 522nm, hoặc với detector PDA ở bước sóng 254nm.

Quy trình này áp dụng cho các loại thực phẩm nước hoa quả, siro hoa quả, sữa....

LeoM.L.Nollet năm [1992], Food analysis by HPLC, p343-365.

Bùi Thị Như Thuận, Phạm Văn Sổ [1975], Kiểm nghiệm lương thực, thực phẩm của, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật – Hà nội, tr 299-305.

4. Định nghĩa: 

5.1 Hệ thống sắc ký lỏng cao áp với detector huỳnh quang FL hoặc detector PDA 

5.2 Cân phân tích độ chính xác 0,0001g

5.3 Cân kỹ thuật độ chính xác 0,01g

5.4 Bếp đun cách thuỷ

5.5 Máy đo pH

5.6 Bình nón 250 ml

5.7 Phễu lọc

5.8 Bình định mức 100, 200 ml

5.9 Lọ thuỷ tinh nâu nút nhám loại 50ml, 100.

5.10. Pipet các cỡ 5. 10,20 ml

5.11. bình định mức các cỡ

Hoá chất thuốc thử sử dụng là loại tinh khiết PA

6.1 Dung dịch HCl 1N

6.2 Dung dịch CH₃COONa 0,05M

6.3 Dung môi Methanol (Merck)

6.4 Men amilase (Prolabo) 

6.5 Acid acetic (Merck)

6.6 Dung dịch vitamin B₂ chuẩn gốc 100ppm:

Cân 0,0250g chuẩn vitamin B₂ dạng riboflavin cho vào bình định mức 250ml, hoà tan và pha loãng tới vạch mức bằng nước. (Lắc và siêu âm để tan hoàn toàn, bọc giấy bạc tránh ánh sáng và bảo quản ở nhiệt độ 4⁰C)

6.7 Dung dịch chuẩn làm việc vitamin B₂ nồng độ 50, 25, 10, 5...ppm pha khi dùng. 

7.1 Chiết vitamin B₂ từ thực phẩm. 

• Xử lý mẫu:

- Đối với mẫu rắn phải nghiền hoặc xay nhỏ và đồng nhất kỹ đóng vào túi nilon hay hộp kín tránh hút ẩm.

- Với mẫu thực phẩm lỏng: Đồng nhất và lắc trộn kỹ.

- Với thực phẩm vừa lỏng vừa rắn phải lấy cả cái và nước đem nghiền kỹ và đồng nhất trước khi cân.

* Tiến hành

- Cân chính xác khoảng 0,1- 10g mẫu cho vào bình nón 250 ml. 

- Thêm vào mỗi bình 10 ml HCl 1N và 90 ml nước

- Thuỷ phân trong nồi cách thuỷ ở 100⁰C trong 1 giờ.

- Chỉnh pH của dịch thuỷ phân đến pH=4,5 bằng dung dịch natri acetat 2,5M.

- Thêm vào mỗi bình 0,1g men Amilase

- Đặt bình vào tủ ấm ủ 370C trong 18 giờ.

- Định mức dung dịch đến 200ml hoặc 250 ml bằng nước cất và lọc.

- Dịch lọc mẫu và chuẩn được bơm vào HPLC

7.2 Xây dựng đường chuẩn: 

Khi thẩm định phương pháp cần phải xây dựng đường đường chuẩn qua 5 điểm. Tuy nhiên do mẫu làm nhiều và phương pháp ổn định quá trình phân tích mẫu hàng ngày chỉ cần tính trên cơ sở một điểm chuẩn nằm trong khoảng tuyến tính.

Các dung dịch chuẩn vitamin B2 để xây dựng đường chuẩn có nồng độ là 20; 10; 5; 1, 0.5...mcg/ml. Dung dịch các chuẩn bơm vào máy HPLC, phần mềm của máy sẽ lập đường chuẩn tương quan giữa diện tích hoặc chiều cao pic với nồng độ chuẩn tương ứng.

7.3 Điều kiện chạy sắc ký.

- Chạy sắc ký với detector FL bước sóng kích thích 422 và bước sóng phát xạ 522nm

- Dung môi pha động Pha động: CH₃COONa 0,05M : MeOH = 70:30 (V/V)

- Cột sắc ký pha ngược C18 

- Tốc độ dòng 1ml/phút

- Nhiệt độ phòng

* Điều kiện chạy sắc ký với detector PDA ở bước sóng 254nm

Dung môi Pha động H2O : MeOH: aceic acid tỷ lệ 45: 65: 0,1 (V/V/V)

Tốc độ dòng 0,8 ml/ phút

Cột RP 18

Căn cứ vào diện tích hay chiều cao pic của mẫu và đường chuẩn xây dựng được, tính hàm lượng vitaminB2 theo công thức sau.

X(mcg/g)= 200 x Cm / m

Trong đó : 200 là thể tích bình định mức của dịch sau thuỷ phân (ml)

Cm là nồng độ mẫu phân tích tính theo đường chuẩn (mcg/ml) hay nồng độ một dung dịch chuẩn.

m Khối lượng mẫu lấy phân tích (g).

Sai lệch giữa hai lần thử song song trong cùng điều kiện so với giá trị trung bình không chênh lệch nhau quá 15%.